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One-Tube Cloning Kit

货号:B101
产品详情
货号
规格
价格
保存条件
B101-01
20 rxns
RMB 1200 600
-20℃

产品介绍

    本品含有的5 × One-Tube Cloning Mix可将单个或者多个片段基于同源重组原理克隆至目标载体,克服了传统酶切连接需要特定酶切位点的缺点,具有DNA使用量少、兼容长短片段、方便简单的特点。重组后的产物可以直接用于转化。反应只需要在恒温仪器里面进行(50℃重组反应5-15min),相比传统酶切连接耗时长缺点,本品有明显的优势。单片段及多片段重组过程如下:

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 图一:单片段重组过程                                                图二:多片段重组过程

产品组成

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产品特点

    任意·无需找酶切位点,不引入额外序列

    简单·预混液,一管Mix解决克隆问题

    快速·重组只需要5-15分钟

产品使用

    A.制备线性化目标载体

    目标载体可以通过酶切方式线性化(推荐使用双酶切,酶切彻底以减少假阳性克隆);或者通过PCR方式线性化(即把需要的骨架部分PCR出来,注意环状质粒作为PCR模板加入0.1 -1.0 ng,以减少假阳性克隆)。PCR扩增推荐使用NovaBio # T202 或者NovaBio # G302)。推荐使用胶回收线性化的目标载体。如下以EcoRI 、BamHI双酶切pUC19为例:

图片.png

    B.获得目标片段

    目标片段扩增引物5’端分别引入与线性化载体两端一致的15-25 bp同源臂序列(酶切位点不计入同源臂长度)。

    PCR扩增推荐使用NovaBio # T202 或者NovaBio # G302,PCR产物纯化后用于下一步实验。

    B.1获得单片段目标片段引物设计(以GAPDH克隆到pUC19载体为例)

    GAPDH用含同源臂的引物扩增(红色的酶切位点序列可以去除,按实际需要处理):

图片.png

    B.2获得多片段目标片段引物设计(以GAPDH与GFP融合克隆到pUC19载体为例)

    B.2.1  GAPDH用含同源臂的引物扩增(红色的酶切位点序列可以去除,按实际需要处理):

图片.png

    B.2.2  GFP用含同源臂的引物扩增(红色的酶切位点序列可以去除,按实际需要处理):

图片.png

    C.重组反应体系

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    ※ ng和pmol转换公式: ng = 0.66  × 片段长度 × pmol (以上体系0.03 pmol即加入 [0.02 ×长度]  ng;以上体系0.06 pmol就是加入 [0.04 ×长度]  ng)

    D.重组反应体系

    单片段重组反应,50℃反应5分钟,之后放入4度或者冰浴中;

    多片段重组反应,50℃反应15分钟,之后放入4度或者冰浴中。

    C.重组反应产物转化

    (使用化学感受态可参照以下步骤,或以使用的感受态说明书为准)

    E.1 在冰上解冻克隆感受态细胞,取10 μl重组产物加入到100 μl感受态细胞中,轻弹管壁混匀,冰上静置30 min。

    E.2  42℃水浴热激45秒,立即冰上冷却2-3分钟。加900 μl SOC或LB培养基(不添加抗生素),37℃摇菌1小时(转速200 - 250 rpm)。

    E.3 将相应抗性的LB平板固体培养基在37℃培养箱中预热。5,000 rpm离心5 min,弃掉900 μl上清。用剩余培养基将菌体重悬,用无菌涂布棒在含有正确抗性的平板上轻轻涂匀。

    E.4  37℃培养箱中倒置培养12-16 h。

    F.克隆鉴定

    PCR鉴定/酶切鉴定/测序

 注:本品仅供科研使用,不能用于人和动物医疗诊断。


One-Tube Cloning Kit产品说明(B101).pdf


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