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One-Tube Cloning Kit                                                 

货　    号：B101

保存条件：- 20 ℃

产品介绍：

本品含有的5 × One-Tube Cloning Mix可将单个或者多个片段基于同源重组原理克隆至目标载体，克服了传统酶切连接需要特定酶切位点的缺点，具有DNA使用量少、兼容长短片段、方便简单的特点。重组后的产物可以直接用于转化。反应只需要在恒温仪器里面进行（50℃重组反应5-15min)，相比传统酶切连接耗时长缺点，本品有明显的优势。单片段及多片段重组过程如下：

产品组成：

产品特点：

任意·无需找酶切位点，不引入额外序列；

简单·预混液,一管Mix解决克隆问题；

快速·重组只需要5-15分钟；

产品使用：

A.制备线性化目标载体

目标载体可以通过酶切方式线性化（推荐使用双酶切，酶切彻底以减少假阳性克隆）；或者通过PCR方式线性化（即把需要的骨架部分PCR出来，注意环状质粒作为PCR模板加入0.1 -1.0 ng，以减少假阳性克隆）。PCR扩增推荐使用NovaBio # T202 或者NovaBio # G302）。推荐使用胶回收线性化的目标载体。如下以EcoRI 、BamHI双酶切pUC19为例：

B.获得目标片段

目标片段扩增引物5’端分别引入与线性化载体两端一致的15-25 bp同源臂序列（酶切位点不计入同源臂长度）。

PCR扩增推荐使用NovaBio# T202 或者NovaBio # G302，PCR产物纯化后用于下一步实验。

B.1 获得单片段目标片段引物设计（以GAPDH克隆到pUC19载体为例）

GAPDH用含同源臂的引物扩增（红色的酶切位点序列可以去除，按实际需要处理）：

B.2 获得多片段目标片段引物设计（以GAPDH与GFP融合克隆到pUC19载体为例）

B.2.1   GAPDH用含同源臂的引物扩增（红色的酶切位点序列可以去除，按实际需要处理）：

B.2.2   GFP用含同源臂的引物扩增（红色的酶切位点序列可以去除，按实际需要处理）：

C.重组反应体系

※ ng和pmol转换公式： ng =0.66   × 片段长度 ×pmol (以上体系0.03 pmol即加入 [0.02 ×长度]   ng；以上体系0.06 pmol就是加入 [0.04 ×长度]   ng)

D.重组反应条件

单片段重组反应，50℃反应5分钟，之后放入4度或者冰浴中；

多片段重组反应，50℃反应15分钟，之后放入4度或者冰浴中。

E.重组反应产物转化

（使用化学感受态可参照以下步骤，或以使用的感受态说明书为准）

E.1在冰上解冻克隆感受态细胞,取10 μl重组产物加入到100 μl感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰上静置30 min。

E.2   42℃水浴热激45秒，立即冰上冷却2-3分钟。加900 μl SOC或LB培养基(不添加抗生素)，37℃摇菌1小时(转速200 - 250 rpm)。

E.3将相应抗性的LB平板固体培养基在37℃培养箱中预热。5,000rpm离心5 min，弃掉900 μl上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有正确抗性的平板上轻轻涂匀。

E.4   37℃培养箱中倒置培养12-16 h。

F.克隆鉴定

PCR鉴定/酶切鉴定/测序

本品仅供科研使用，不能用于人和动物医疗诊断