关于高保真酶
一、
DNA聚合酶（DNA polymerase）是细胞复制DNA的重要作用酶。DNA聚合酶 ,以DNA为复制模板，从将DNA由5'端点开始复制到3'端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具备模板、引物、dNTP等的情况下）及其相辅的活性。
高保真DNA聚合酶保真性的一个通用标准是错配率，错配率越低保真性越好。
普通DNA聚合酶的错配率在10-5碱基/循环数，而高保真DNA聚合酶错配率可降到10-6数量级，大大降低了出错的可能性；它适合对PCR保真性要求较高的实验，如基因筛选、测序、突变检测等
高保真DNA聚合酶的保真原理是：高保真DNA聚合酶具有3'到5'核酸外切酶的活性，PCR扩增途中如果产生了错配的碱基，它可以将其切掉，从而保证了扩增的准确性.
高保真DNA聚合酶的外切活性会导致PCR反应之后不会加尾，所以如果要进行TA克隆，要先进行PCR产物回收（否则影响加尾），然后回收产物用普通Taq酶72度保温一段时间，从而利用普通Taq酶加尾的活性。
二、
一代DNA聚合酶：纯化发酵产物得到的DNA聚合酶，或对酶蛋白进行抗体或化学修饰以达到热启动。目前市面的DNA聚合酶，绝大部分是一代酶，如金牌酶、Phusion高保真酶等。
第二代基因工程DNA聚合酶：通过对酶的基因序列进行改造，进而改变酶蛋白的氨基酸序列，通过分子进化平台对酶性能进行筛选，选择符合特定实验要求的酶。如KAPA2G Fast,2G Robust，HiFi Fiedlity ，Long Range酶，G5 High-Fidelity DNA Polymerase等。
酶接进化 | 新贝生物技术平台 |
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三、
G5 High-Fidelity DNA Polymerase聚合酶是一种新型的单酶体系，同其他的高保真酶和聚合酶品牌相比具有行业领导性能。G5 High-Fidelity DNA Polymerase高保真酶进行了基因改造，增加了对DNA的亲和力，不需要结合额外的蛋白域。G5 High-Fidelity DNA Polymerase聚合酶具有的高合成能力导致产量、灵敏度、效率、目的片段长度和扩增困难模板（例如高GC含量）能力的显著提高，使用一个单一酶实现高保真PCR的标准化。
热启动配方中，酶是结合在一个特定的载体上，使其在第一步变性之前一直保持灭活的状态。这样就消除了反应设定和启动过程中非特异性启动导致的产物扩增，进而增加了整体反应的效率和灵敏度。
G5 High-Fidelity DNA Polymerase高保真DNA聚合酶是二代基因工程酶，具有以下特点：
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四、
合成能力被定义为聚合酶每个结合单位合成的核苷酸数量，同时也是延伸速度和稳健性的主要决定因素。相比于融合技术将DNA结合蛋白链接到Pfu-like聚合酶来提高合成能力，G5 High-Fidelity DNA Polymerase高保真DNA聚合酶经过基因工程改造，增加了DNA的亲和力，而不需要辅助蛋白质域。这种内在的高合成能力导致产量、灵敏度、速度、模板长度以及对困难模板扩增能力的显著提升，
当执行高保真PCR时，在产生足够的产物用于克隆的前提下减少循环数是很重要的。额外的循环数增加了产量却降低了保真性：反应早期少量的错配都是固定的，此后在每一个连续循环中都得到放大。在随后的周期，任何额外的错误都将导致突变扩增的比例增加。
酶 | G5 High-Fidelity DNA Polymerase高保真热启动酶 | Pfu酶 | Taq酶 |
来源 | 工程酶 | 嗜热古细菌 | 水生栖热菌 |
错误率 | 2.8 x 10-7 | 2.2 x 10-6 | 2.6 x 10-5 |
延伸速率（nt/sec） | 50-75 | 25 | 61 |
合成能力（nt）** | >100 | >20 | >42 |
**合成能力定义为一分子的DNA聚合酶在催化反应中延伸的核苷酸数量。
五、
1.
G5 High-Fidelity DNA Polymerase高保真酶扩增的出错率是野生型Taq酶的1/100，是Taqblends的1/40，是野生型Pfu的1/3，是Phusion的1/2。
2.
G5 High-Fidelity DNA Polymerase用于扩增的hgDNA目的片段最多达到11 Kb。每个目的片段长度的产物扩增的hgDNA模版浓度范围为（50毫微克至0.5纳克每反应） 。25μL反应体系， 采用标准的3步法的循环扩增（ 35个循环） ： 15秒20秒变性，退火， 30秒/kb延长时间。总的反应时间为11 kb的扩增子是3小时50分钟。 每个反应加12.5微升进行电泳
3.
G5 High-Fidelity DNA Polymerase聚合酶在扩增困难模版上具有强大的性能
4.
单酶校正聚合酶的一个主要的限制就在于损坏的核苷酸和引物降解导致的低灵敏度。经过基因工程改造的新贝生物G5 High-Fidelity DNA Polymerase聚合酶在灵敏度方面有巨大的提高，胜过Fusion技术聚合酶和其他品牌的聚合酶。
六、 G5 High-Fidelity DNA Polymerase高保真DNA聚合酶的应用：
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七、
问题 | 可能原因 | 解决方案 |
无产物 | 目的片段过长； | 减少目的片段大小，扩增最大片段长度：基因组DNA15kb，质粒或噬菌体DNA为18kb； |
高GC或存在DNA二级结果； | 使用GC缓冲液； | |
模板其实浓度过低； | 模板需要量：质粒或噬菌体DNA≥5ng，基因组DNA为50ng，若模板量无法增加，则增加循环数； | |
Mg离子浓度过低。 | 梯度优化Mg离子浓度，每个梯度增加0.25mM。 | |
电泳结果弥散 | 模板浓度过低； | 模板需要量：质粒或噬菌体DNA≥5ng，基因组DNA为50ng，若模板量无法增加，则增加循环数； |
退火温度过低； | 提高退火温度； | |
高GC或存在DNA二级结构； | 使用GC缓冲液； | |
模板降解或破坏； | 确保模板DNA提取/保存方法正确。DNA保存于TE或10mM Tris，减少反复冻融数； | |
Mg离子浓度过高。 | 试剂盒配套的两种buffer中都含有Mg离子，一般不需要额外添加； | |
产量低 | 模板浓度过低； | 模板需要量：质粒或噬菌体DNA≥5ng，基因组DNA为50ng，若模板量无法增加，则增加循环数； |
高GC或存在DNA二级结构； | 使用GC buffer； | |
Mg离子浓度过低； | 梯度优化Mg离子浓度，每个梯度增加0.25mM； | |
dUTP污染； | 使用高质量的dNTPs； | |
引物浓度过低。 | 推荐引物终浓度为0.3uM，扩增长片段需要相对较高的引物浓度。 |
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