PCR Master Mix的成分及使用简介

PCR Master Mix的成分及使用简介

进行PCR试验时，往往要向PCR管中加入buffer、dNTP、DNA酶、引物、模板、水等各种PCR反应所需的试剂，而在加入这些试剂时如果操作不规范很容易造成污染，导致PCR结果不准确，因此，为了简化反复添加各种试剂便将buffer、dNTP、DNAPolymerase等试剂先混合到一起，即配制成Master Mix然后再使用，即简化了PCR操作步骤，也减少了污染的途经。

一、简介：

2×PCR Master Mix中含有2×TaqDNA Polymerase，2×PCR Buffer，2×dNTP，只需加入适量引物、模板和水即可进行PCR扩增。大大简化了PCR操作，使操作更加快捷，也减少了PCR操作过程中可能导致的污染，使PCR的重复性更好。

利用2×PCR Master Mix可以进行各种常规的PCR扩增，特别适合用于定量和半定量的PCR扩增，以及2kb以下DNA片断的T载体克隆。

2×PCRMasterMix可以扩增出长达8kb的片断，但通常更适合用于扩增2kb以下的DNA片断。可以选用新贝生物-NovaBio的2×Ultra Taq PCR Mix (www.xinbeibio.com/pd.jsp?id=37)

二、保存条件：-20℃保存。

三、注意事项：

1、由于PCR反应非常灵敏可以扩增目的基因序列超过1000万倍，在使用Taq酶时请注意避免微量待扩增DNA的污染，并尽量考虑设置不加模板的空白对照以确认是否有待扩增DNA的污染。

2、Taq DNApolymerase在PCR过程中每循环的出错几率约为2.2x10^-5，对于大于1kb的DNA片断的克隆推荐使用出错几率更低的DNA聚合酶，例如Pfu DNA polymerase、G5 DNA polymerase、ultra DNA polymerase等。对于普通的PCR或RT-PCR定性检测或定量检测，TaqDNA polymerase是最佳选择。

3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

四：体系配置

2×UltraTaq PCR Mix冰上解冻后混匀备用，在冰上依次加入以下组分：

DNasefree H2O                             补足至 50^※μL                      补足至 20^※ μL              补足至 10^※ μL

上游引物（10 μM）                                     1μL                                        0.4 μL                       0.2 μL

下游引物（10 μM）                                     1μL                                        0.4 μL                       0.2 μL

模板                                                        X* μL                                         X* μL                               X* μL

2×UltraTaq PCR Mix                                      25 μL                                         10 μL                        5 μL

※可以等比例降低体系体积，但不要小于10 μL。

*加入模板量一般真核基因组10 - 100 ng，细菌基因组1 - 10 ng，质粒0.1 - 1 ng，未稀释cDNA体积不要超过体系的1/10体积。

五、常见问题：

1.PCR产物非常少或没有特异性条带。

a.引物设计不佳是PCR过程中最常见的问题。请选择适当的引物设计软件进行引物设计，注意引物的GC含量、二级结构、二聚体、退火温度、长度、特异性等方面的问题。在加入酶切位点等的引物中，一定要注意加入酶切位点等后整条引物的GC含量、二级结构、二聚体、退火温度、长度、特异性等方面的问题。在原有引物效果不佳的情况并且阳性对照引物可以正常工作的情况下，可以考虑更换引物。

b.待扩增片断GC含量偏高。GC含量较高的情况下PCR会变得相对比较困难，此时可以使用适合扩增高GC含量DNA片断的GC-richbuffer，并相应地根据GC-rich buffer的要求或说明调整PCR反应参数的设置，可以使用新贝生物-NovaBio的PCR GC Enhancer(www.xinbeibio.com/pd.jsp?id=67)。

c.长片断扩增。尽管Taq DNApolymerase可以扩增最长达8kb的DNA片断，但大多数时候比较适合扩增3kb以下的片断，更长片断的扩增推荐使用其它更适合长片断扩增的DNA聚合酶，可以使用新贝生物-NovaBio的高保真酶Mix - 2×G5 High-Fidelity PCRMix(www.xinbeibio.com/pd.jsp?id=33)。

d.PCR反应设置时在室温进行容易导致非特异性条件。推荐在冰浴上设置PCR反应。

e.由于引物存在一定的二级结构或存在一定的引物二聚体，或引物偏短，导致退火效果不佳。此时可以采用Touch down等方法进行退火，通常采用从65℃逐步缓慢降温到55或50℃的方法，使退火更加充分。

f.退火温度不佳，需要优化。如果有温度梯度PCR仪，则可以设置退火的温度梯度，摸索退火的最佳温度。如果没有温度梯度PCR仪，则可以通过多次PCR反应摸索最佳的退火温度。

g.延伸时间不足。可按照每1kb片断延伸1分钟进行设置，对于较难扩增的片断可以设置为每1kb片断延伸1.5-2分钟。

h.待扩增片断GC含量较高或长度较长，变性不够充分。可以调节起始变性条件至95℃1min甚至95℃2-4min。

i.在不同PCR仪上进行PCR反应，避免有时PCR仪出现问题。

j.循环数不足，适当延长PCR的循环数。通常循环数最高不必超过40，常用的循环数范围为25-35。

k.模板含量太低，适当加大模板量，或采用巢式PCR(nested PCR)或二次PCR。巢式PCR即为在原先设计的PCR引物内侧再设计一对PCR引物，然后对第一次PCR产物进行稀释后再进行一次PCR扩增，这样一方面可以起到扩增作用，同时也可以从第一次PCR产物中扩增出特异性条带。二次PCR则为比较简单地用原有引物对第一次PCR产物进行稀释后再进行一次PCR扩增，可以起到扩增作用，但不能去除非特异性条带。

l.模板中含有抑制PCR反应的物质，可以用适当的DNA纯化方法例如柱纯化等纯化模板DNA。

m.当产生较多非特异性条带时，可以适当提高退火温度。

n.注意设置适当的阳性对照和阴性对照通常会有很大帮助。

PCR Master Mix现今已经广泛应用在各种PCR实验中，如Real Time PCR、多重PCR、巢式PCR等。使用PCRMaster Mix即可以简化实验操作，又可以避免因多次对PCR管进行操作所造成的污染问题。